Sabor je nedavno ugostio brojne zvijezde pokreta protivnika cijepljenja, na poziv zastupnika Domovinskog pokreta Stjepe Bartulice. Gotovo osam sati govorili su o cjepivima protiv Covida, no dvije su se teme iskristalizirale kao najvažnije. Prva je mogu li cjepiva uzrokovati tzv. “turbo karcinome”, o čemu smo pisali. Druga tema je količina i značenje kontaminacije vakcina u proizvodnom procesu.
U Saboru je o nečistoćama pronađenim u mRNA cjepivima govorio Kevin McKerman, nekadašnji voditelj istraživanja i razvoja (R&D) za MIT-jev Human Genome Project, a trenutno glavni znanstveni direktor u Medicinal Genomics. Autor je neobjavljenih radova na temu DNA kontaminacije u Covid cjepivima [1, 2]. McKernan je otvoreno priznao da je koristio bočice nepoznatog porijekla. U slučaju starijeg, monovalentnog Pfizerovog Comirnatyja, testirao je bočice kojima je prošao rok, a u slučaju novijeg, bivalentnog cjepiva bočice su bile otvorene.
Pritom, u svome radu na 13. stranici naveo je i: “Ove su nam bočice anonimno poslane poštom bez hladnih paketa.” Zbog nestabilnosti mRNA molekula, Pfizerova cjepiva moraju se čuvati na -90°C do -60°C pri transportu te na 2°C do 8°C nakon odmrzavanja, no McKernan ovo ne smatra presudnim za analiziranje DNA pronađenog u cjepivu.
McKernanove teze
McKernanove teze u Saboru mogu se razvrstati u tri kategorije. Prvo, kazao je da je Pfizer u kliničkom ispitivanju Comirnatyja koristio drugačiji proizvodni proces već kod puštanja cjepiva u masovnu primjenu.
“Kod Pfizera su se tijekom kliničkog ispitivanja i kod proizvodnje (za masovno cijepljenje) koristili različiti (proizvodni) procesi. Prvi je bio čist, kada se koristila in vitro transkripcija (IVT) i kroz PCR su povećavali koncentraciju DNA… U drugom procesu su to izbacili i nije se desilo pročišćenje pa smo imali kontaminaciju cjepiva.”
Drugo, McKernan je naveo i da je u cjepivu prisutna sekvenca virusa SV40, “koja se koristi u genskoj terapiji”. Inače, virus SV40 se smatra onkogenim kod životinja, konkretnije glodavaca, dok veza s rakom kod ljudi nije jednoznačno dokazana. Konkretnije, McKernan je kazao:
Nema sumnje da je SV40 sekvenca prisutna, to su regulatori potvrdili, i sada je pitanje što to znači, koje su kliničke implikacije.
Treće, kazao je kako su cjepiva oblik genske terapije; da pronađene DNA molekule mogu dovesti do integracijske mutageneze – mogućnosti da se rezidualna DNA ugradi u genom – što za posljedicu može imati izazivanje raka. McKernan je ustvrdio i da DNA može djelovati protrombotski, ilustrirajući to radom iz 2017. te da su pronađena onečišćenja bakterijskim DNA vezana za endotoksine, što može dovesti do anafilakse.
Najprije ćemo se pozabaviti proizvodnim procesom.
Dva proizvodna procesa
Drugi proces proizvodnje o kojemu je govorio McKernan tiče se umnažanja plazmida u bakteriji Echerichia coli (E. Coli), za koji McKernan tvrdi da je “milijun puta prljaviji”, zbog čega cjepiva sadrže i plazmidnu i bakterijsku DNA.
Plazmid je kružna dvolančana DNA molekula, koja se koristi u genskom inženjerstvu. Plazmidi se nalaze u bakterijama, no nisu dio njenoga kromosoma, nego se umnažaju neovisno u stanici. Bakterije se mogu modificirati tako da preuzmu plazmid, nakon čega ga umnažaju u stanici. Kod proizvodnje željenih DNA ili mRNA molekula, u plazmid se prije umnažanja u bakteriji može umetnuti gen ili sintetički skrojena mRNA s komplementarnim nizom nukleotida.
Početkom 2021. ovaj proces je detaljno opisao NYT, kao i kontrolu kvalitete te čistoće cjepiva. No, zanimalo nas je je li Europska agencija za lijekove bila svjesna ovog “procesa 2” prije hitnog odobrenja i početka masovne kampanje cijepljenja.
U odgovoru Faktografu, EMA navodi da nisu samo znali za njega, već i da je cjepivo proizvedeno u tzv. “procesu 2” – korišteno u kliničkoj studiji.
“Serije aktivnih tvari proizvedene dvama procesima (proces 1 i proces 2) uključene su u klinička ispitivanja. U početnoj prijavi za uvjetno odobrenje za stavljanje na tržište (CMA), podnositelj zahtjeva pružio je detaljne analitičke rezultate testiranja i potporne informacije kako bi dokazao da su aktivne tvari proizvedene postupkom proizvodnje 1 i postupkom 2, te odgovarajući gotov proizvod, usporedivi u pogledu bioloških, kemijskih i fizikalnih karakteristika.” Usporedivost je termin koji se inače koristi u EMA-inim smjernicama proizvođačima ako dođe do promjene u procesu proizvodnje, što se učestalo dešava.
U slučaju Pfizera, procjena usporedbe “potvrdila je da nema značajne razlike u kvaliteti materijala između procesa 1 i procesa 2 koja bi mogla utjecati na sigurnost i/ili učinkovitost cjepiva”. Usporedivost aktivne tvari i gotovog proizvoda ponovno se potvrđuje na ovaj način svaki put kada se naprave značajne promjene nakon odobrenja, a EMA za primjer navodi povećanje proizvodnje ili dodavanje novih proizvodnih mjesta.
“Demonstracija usporedivosti na ovaj način normalan je dio farmaceutskog razvoja i upravljanja životnim ciklusom bioloških lijekova i cjepiva sukladno utvrđenim znanstvenim smjernicama”, navodi EMA.
Da, DNA može zaostati, ali ne može biti iznad ograničenja
O proizvodnji mRNA Covid cjepiva uz pomoć plazmida u bakterijama Europska agencija za lijekove (EMA) se očitovala 1. prosinca ove godine:
“mRNA u Comirnatyju i Spikevaxu proizvedena je s pomoću plazmidne DNA. Plazmidi se prirodno pojavljuju u bakterijskim stanicama. Koriste se kao predložak za proizvodnju mRNA cjepiva. Nakon što se proizvede mRNA, proizvodni proces uključuje korake za razgradnju i uklanjanje plazmidne DNA jer više nije potrebna. Plazmidna DNA nije namijenjena da bude dio konačnih mRNA cjepiva. Međutim, vrlo male količine fragmenata DNK mogu ostati. EMA nije vidjela dokaze koji povezuju rezidualni DNK s nuspojavama. EMA je postavila ograničenja za razinu razgrađene DNA u mRNA cjepivima. Proces proizvodnje pažljivo je osmišljen i kontroliran kako bi se osigurale sigurne i prihvatljive razine, a kvaliteta cjepiva se rutinski provjerava.”
Je li “Proces 2” neočekivan i stvarno tako prljav?
O umnažanju mRNA za cjepiva uz pomoć E. coli razgovarali smo s profesoricom molekularne genetike Ivanom Ivančić Baće i docentom sa Zavoda za biokemiju Markom Močibobom s Prirodoslovno matematičkog fakulteta. Zanimalo nas je je li proizvodnja mRNA uz pomoć E. coli nešto što se nije moglo očekivati kada dođe do masovne proizvodnje, je li to rizično i je li bilo adekvatno najavljeno (regulatorima) i ispravno deklarirano. Naravno, zanimalo nas je i postoji li razlika u kvaliteti, kao što pojedini znanstvenici tvrde (BMJ).
Ivančić Baće pojašnjava da E. coli samo služi da se umnoži plazmid koji je kalup za sintezu mRNA. Bakterija E. coli može se izbjeći metodom PCR, tako da se umnoži samo gen s plazmida. No, u E. coli se umnaža cijeli plazmid.
“Umnažanje DNA na oba načina je ispravno i nikako ne utječe na daljnje korake i kvalitetu u smislu sigurnosti i točnosti, ako se DNA dobro pročisti i provjeri da nema mutacija. Svi daljnji koraci bi trebali ići s IVT – sve je in vitro transkripcija i ovisi o kvaliteti RNA polimeraze i kalupa. Uvijek se može nešto dogoditi prilikom sinteze, ali oni to sve provjeravaju, tako barem tvrde”, navodi profesorica.
Močibob navodi kako se ne smatra ekspertom za proizvodnu farmaceutiku, ali zna da se pogoni za proizvodnju lijekova općenito strogo nadziru, kao i da “nije dozvoljeno mijenjati proizvodni proces bez znanja i dozvole regulatora”.
“Što se tiče predloška DNA za transkripciju in vitro (IVT), rutinski se koristi i DNA umnožena PCR-om kao kalup za dobivanje mRNA i plazmidi umnoženi u bakteriji Escherichia coli. Tako da tu ne vidim neki osobiti problem”, navodi on.
Rizik od mutacija
Kada govorimo o riziku, upitali smo Močiboba o činjenici da pojedini proizvođači mRNA-e reklamiraju svoj IVT s tvrdnjom “nema rizika od insercijske mutageneze“. On kaže da je rizik za ugradnju u genom, “jednak za oba procesa – nepostojeći”.
“‘Nema rizika od insercijske mutageneze’ je jednostavno statement kao da na biljne proizvode stavite deklaraciju ‘0 % kolesterola’ – naravno, jer biljke ne proizvode kolesterol, kolesterol može biti prisutan samo u životinjskim namirnicama”, tvrdi Močibob.
Isto navodi i američka Agencija za hranu i lijekove, FDA. Nedavno su u odgovoru “ministru zdravstva” američke savezne države Floride, Josephu Ladapu [1, 2], pismeno odgovorili na pitanja koja je pokrenuo McKernan.
Sekvenca SV40
FDA se, naime, očitovao o sekvenci pojačivača SV40 koju je McKernan pronašao u svojim ispitivanjima i za koju navodi da su je regulatori “priznali”, bez da znaju kakve su posljedice njenog prisustva. Ta zaostala sekvenca, navodi FDA, neće “kodirati niti jedan protein SV40”. Osim toga, “prilično je nevjerojatno da bi preostali mali fragmenti DNA smješteni u citosolu mogli pronaći put do jezgre kroz jezgrenu membranu prisutnu u netaknutim stanicama i zatim biti uključeni u kromosomsku DNA. [2]”.
U odgovoru se referiraju i na istraživanja provedena na životinjama. U njima je korištena modificirana mRNA i lipidne nanočestice koje zajedno čine cjepivo, kao i rezidualni DNA fragmenti, koji se mogu pronaći u tragovima nakon tretmana DNazom – enzimom za razgradnju DNA – tijekom proizvodnje.
“Nisu pokazala nikakve dokaze genotoksičnosti iz cjepiva. [3] Podaci farmakovigilancije u stotinama milijuna pojedinaca također ne ukazuju na dokaze koji upućuju na genotoksičnost”, navodi FDA.
Ministarstvo zdravstva Kanade, na koje se McKernan također poziva, kaže da je u cjepivima pronađena sekvenca pojačivača promotora SV40, što nije isto što i netaknuti virus SV40, koji je onkogen. Istovremeno opovrgava da su te sekvence potencijalno štetne.
“Sekvencija pojačivača promotora SV40 pronađena je kao zaostali fragment DNA u Pfizer-BioNTech COVID-19 cjepivu,” izjavili su za AFP. “Fragment je neaktivan, nema funkcionalnu ulogu i konzistentno je izmjereno da je ispod granice koju propisuju Health Canada i drugi međunarodni regulatori.”
Zašto se u cjepivu može pronaći zaostala sekvenca SV40?
SV40 je virus koji je prisutan u prirodi, no on se ne koristi u proizvodnji cjepiva. Ono što se često koristi u plazmidima pri proizvodnji bioloških pripravaka jesu specifične sekvence za neinfektivne dijelove SV40.
“SV40 enhancer, odnosno pojačivač, je genetički element, mali djelić DNA iz Simian Virus 40 koji se već desetljećima koristi u laboratorijima i laboratorijskim pokusima genetičkog inženjeringa. Sâm za sebe, taj komadić DNA je potpuno bezopasan, i ne vidim nikakve poveznice sa strahovima i tvrdnjama koje se plasiraju. Najvažnije, djelić virusne DNA (SV40 enhancer) izvan svog domaćina (virusa SV40) nema nikakve veze s izvornim virusom i opasnostima koje taj virus nosi. Otprilike kao da izvadite bilo koji mehanički dio iz automobila: takav kotač, zupčanik, remen, klip, svjećica…. neće imati ama baš nikakva svojstva tog vozila kao cjeline. Ali ga možda možete upotrijebiti kao rezervni dio ili komponentu za neko drugo vozilo ili stroj”, pojašnjava nam Močibob.
EMA također ističe kako “sekvenca za neinfektivne dijelove SV40 čini samo mali dio cjelokupne sekvence SV40” te je ona “prisutna u početnom materijalu DNA plazmida Comirnatyja”. No, u ovom slučaju, “sekvencija nije izravno relevantna za proizvodnju plazmida u E. coli ili za proces proizvodnje mRNA, pa se smatra nefunkcionalnim dijelom strukture izvornog plazmida”.
Razgradnja i dozvoljene količine
“Tijekom proizvodnog procesa, ova sekvencija i druge sekvence plazmidne DNA razgrađuju se i uklanjaju. Fragmenti sekvence SV40 mogu biti prisutni samo kao preostale nečistoće na vrlo niskim razinama koje se redovito kontroliraju”, navodi Agencija. Kako je McKernan navodio i kako je prisustvo sekvence SV40 zataškana u Pfizerovoj aplikaciji, EMA objašnjava i taj dio:
“Iako je puna DNA sekvencija početnog plazmidnog materijala bila navedena u početnom zahtjevu za odobrenje stavljanja na tržište za Comirnaty, podnositelj zahtjeva nije posebno istaknuo sekvencu SV40, jer se smatralo da je nefunkcionalni dio plazmida. Oni su od tada pojasnili ovu informaciju u odgovoru na pitanja koje je postavila EMA”, pišu nam iz Agencije.
EMA je postavila odgovarajuće granice za razinu preostale DNA u cjepivima i u odgovoru nas uvjeravaju “da nismo vidjeli pouzdane dokaze o preostaloj DNA koja prelazi odobrene/sigurne razine ni za jedno od mRNA cjepiva odobrenih u EU, bilo za Comirnaty ili Spikevax”. Zaključuju da je proizvodni proces mRNA cjepiva pažljivo dizajniran i kontroliran kako bi se osiguralo da razina preostale DNA bude ispod prihvatljivih i sigurnih razina.
Onkolog David Gorski u analizi je jednog od radova na temu kontaminacije ustvrdio kako su količine pronađenih DNA u cjepivima u slučajevima pojedinih sekvenci upola manje od regulatornih limita, kod drugih dosežu jednu desetinu, a trećih čak jednu stotinu propisanog minimuma.
“Dakle, prema podacima samih McKernana i Rose, ampula s najvećom koncentracijom DNA bila je Pfizerova ampula koja je imala manje od polovice maksimalne količine DNA preporučene od strane FDA, dok je Modernina ampula s najvećom kontaminacijom plazmidnom DNA imala manje od desetine maksimalne preporučene od strane FDA. Drugim riječima, jedno veliko ništa”, piše Gorski na svom blogu.
Regulatori ne raspolažu informacijama da bi rezidualna DNA mogla naškoditi primateljima cjepiva
Zaključno, EMA-u smo upitali i o sumnji da bi rezidualni DNA u cjepivima mogao biti onkogen, protrombotski i da nosi rizik od insertacijske mutageneze. Odgovarajući o sekvenci SV40, EMA je eksplicitno navela da “nema znanstvenih dokaza da bilo koji od ovih fragmenata SV40 može djelovati kao insertacijski mutagen”.
Nadalje, “EMA nije vidjela nikakve dokaze o povezanosti između mRNA cjepiva i nuspojava koje bi mogle biti povezane s prisutnošću DNA materijala, niti smo svjesni znanstvenih dokaza koji pokazuju da vrlo male količine preostale DNA koje mogu biti prisutne u serijama cjepiva mogu integrirati u DNA cijepljenih osoba”.
Zaključuju da Agencija i države članice EU-a kontinuirano prate sigurnost svih Covid-19 cjepiva kako bi se osiguralo da se mogući rizici detektiraju i upravljaju što je prije moguće. EMA pažljivo procjenjuje sumnje na nuspojave kako bi utvrdila mogu li biti uzrokovane cjepivom. Navode i kako su nedavno objavili izvješće o praćenju sigurnosti lijekova tijekom pandemije.
Inače, male količine rezidualne DNA mogu se pronaći i u drugim odobrenim cjepivima, kao što su ona protiv gripe i hepatitisa [1, 2]. Zaključak prepuštamo profesoru Odjela za mikrobiologiju i imunologiju Sveučilišta Michigan Michaelu J Imperialeu, koji u izjavi za Health Feedback napominje da McKernanove predobjave članaka nisu prošle stručnu recenziju i da je u toj fazi nemoguće znati je li doista došlo do značajne kontaminacije DNA.
“Siguran sam da FDA ne dopušta puštanje u promet serija cjepiva s takvom kontaminacijom”, dodaje. Smatra i da nema dokaza da se SV40 sekvencija može integrirati. Čak i ako bi DNA ušla u jezgru, integracija bilo kojeg plazmida u genom stanice bila bi izuzetno rijetki događaj, a još je manja mogućnost da mutirane stanice prežive imunološki sustav.
